Em 1999, reconhecendo a escassez de medicamentos eficazes nas regiões mais pobres do mundo onde trabalhava, a organização Médicos Sem Fronteiras (MSF) formou uma equipe de especialistas internacionais com o objetivo de estudar a crise na área de pesquisa e desenvolvimento (P&D) de medicamentos para as doenças negligenciadas. Este Grupo de Trabalho sobre Medicamentos para Doenças Negligenciadas analisou as causas da crise e, estudando estratégias inovadoras para assegurar o desenvolvimento de medicamentos novos e acessíveis para as doenças negligenciadas, recomendou a criação de uma nova iniciativa, a DNDi.

Em 2003, sete organizações de diferentes regiões do mundo uniram forças para fundar a DNDi: cinco instituições do setor público – a Fundação Oswaldo Cruz do Brasil, o Conselho Indiano de Pesquisa Médica da Índia, o Instituto de Pesquisa Médica do Quênia, o Ministério da Saúde da Malásia e o Instituto Pasteur da França; uma organização humanitária – Médicos sem Fronteiras (MSF); e uma organização internacional de pesquisa – o Programa Especial para Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais (TDR) do Programa das Nações Unidas para o Desenvolvimento (PNUD) / Banco Mundial/Organização Mundial da Saúde (OMS), que atua como observador permanente da organização. Durante 30 anos, MSF tem testemunhado diretamente o custo humano resultante da falta de medicamentos para as doenças negligenciadas e tem se manifestado contra a iniqüidade; o Instituto Pasteur investe intensamente em pesquisas biológicas sobre doenças infecciosas; o TDR trabalha com 10 doenças infecciosas negligenciadas que afetam as populações pobres marginalizadas; a Fundação Oswaldo Cruz dedica seus recursos à P&D médica; o Conselho para a Pesquisa Médica da Índia patrocina e coordena pesquisas médicas nesse país; e o Ministério da Saúde da Malásia trabalha na criação de parcerias voltadas para a saúde.

A DNDi constituiu-se como entidade jurídica em julho de 2003.